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介绍大鼠心肌细胞H9C2的试剂配制及实验步骤

发表时间:2021-12-26  |  点击率:381
  H9c2(2-1)是由B.Kimes和B.Brandt从胚胎BD1X大鼠心脏组织衍生的原始克隆细胞系的亚克隆,并且表现出骨骼肌的许多特性。该系中的成肌细胞将融合形成多核肌管并响应乙酰胆碱刺激。如果培养基中的血清浓度降至1%,则融合发生得更快。
  一、大鼠心肌细胞H9C2试剂配制:
  (1)PBS磷酸盐缓冲液:PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL,调pH7.2,121℃,30min高压灭菌,4℃冰箱保存。
  (2)DMEM-F12细胞生长培养液:临用前根据需要按体积比10%加胎牛血清,最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100U/mL,置于4℃冰箱保存。
  (3)心肌细胞培养基:DMEM/F12+10%胎牛血清(Hyclone)+1%双抗+Brdu(终浓度为0.1mmol/L),0.2um一次性过滤器过滤除菌,制备100ml,现配先用。
  (4)0.125%胰酶消化液:将实验室现有的0.25%胰酶消化液用蒸馏水稀释2倍。
  二、大鼠心肌细胞H9C2实验步骤:
  (1)取出生7d内新生乳大鼠,烧杯装载放入细胞间,另准备75%酒精,先用镊子使乳鼠颈部脱臼致死,在75%酒精中浸泡至少1min,然后固定在泡沫板上,先用碘酒消毒胸腹部,再用酒精消毒。取出无菌剪刀和镊子,先用酒精棉球再次消毒,剪开胸,取心尖部位,快速置于含双抗的预冷的PBS溶液润洗3次。
  (2)剔除周围结缔组织,将心脏置于无菌平皿中,将心脏尽量剪碎,平皿内加入适量0.125%的胰酶,在37℃培养箱中,采用分次消化,每次消化5min,一共消化8-10次。
  (3)每次消化后取上清液,并加入等量的含10%的DMEM/F12培养基,轻轻混匀,中和胰酶的消化,防止消化过度。用200目细胞过滤筛子过滤含细胞的混合液,最后将过滤后的细胞悬液1000rpm离心5min。离心后收集沉淀,用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬,接种于细胞培养瓶中培养。
  (4)培养90min左右,将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞。
  (5)将未贴壁的细胞悬液放入新的培养瓶中继续培养,并每日观察心肌细胞的生长。
  
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