介绍大鼠心肌细胞H9C2的试剂配制及实验步骤

　　H9c2（2-1）是由B.Kimes和B.Brandt从胚胎BD1X大鼠心脏组织衍生的原始克隆细胞系的亚克隆，并且表现出骨骼肌的许多特性。该系中的成肌细胞将融合形成多核肌管并响应乙酰胆碱刺激。如果培养基中的血清浓度降至1％，则融合发生得更快。

　　一、大鼠心肌细胞H9C2试剂配制：

　　（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min高压灭菌，4℃冰箱保存。

　　（2）DMEM-F12细胞生长培养液：临用前根据需要按体积比10%加胎牛血清，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100U/mL，置于4℃冰箱保存。

　　(3)心肌细胞培养基：DMEM/F12+10%胎牛血清（Hyclone）+1%双抗+Brdu(终浓度为0.1mmol/L)，0.2um一次性过滤器过滤除菌，制备100ml，现配先用。

　　（4）0.125%胰酶消化液：将实验室现有的0.25%胰酶消化液用蒸馏水稀释2倍。

　　二、大鼠心肌细胞H9C2实验步骤：

　　（1）取出生7d内新生乳大鼠，烧杯装载放入细胞间，另准备75%酒精，先用镊子使乳鼠颈部脱臼致死，在75%酒精中浸泡至少1min，然后固定在泡沫板上，先用碘酒消毒胸腹部，再用酒精消毒。取出无菌剪刀和镊子，先用酒精棉球再次消毒，剪开胸，取心尖部位，快速置于含双抗的预冷的PBS溶液润洗3次。

　　（2）剔除周围结缔组织，将心脏置于无菌平皿中，将心脏尽量剪碎，平皿内加入适量0.125%的胰酶，在37℃培养箱中，采用分次消化，每次消化5min，一共消化8-10次。

　　（3）每次消化后取上清液，并加入等量的含10%的DMEM/F12培养基，轻轻混匀，中和胰酶的消化，防止消化过度。用200目细胞过滤筛子过滤含细胞的混合液，最后将过滤后的细胞悬液1000rpm离心5min。离心后收集沉淀，用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬，接种于细胞培养瓶中培养。

　　（4）培养90min左右，将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞。

　　（5）将未贴壁的细胞悬液放入新的培养瓶中继续培养，并每日观察心肌细胞的生长。