小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养要注意的事项

     小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为原代培养细胞，其刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面保持干细胞的未分化状态。虽然MEF传代次数有限，但可早期冻存一些，不断复苏，保持长期使用。MEF的缺点是无法耐受G418的筛选。替代方法是从持续表达neo抗性的小鼠品系或转基因品系来分离培养MEF。利用各种转基因鼠培养的MEF细胞还是各种基因功能研究的良好工具。

　　（一）材料

　　12.5~14.5d的小鼠胚胎(3~6只小鼠／次），培养皿（直径10cm),DMEM+10%新生牛血清，15cm或50cm离心管（圆底），PBS配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手术刀、镊子、剪子等器械。

　　（二）操作步骤

　　1.一般操作

　　(1)在培养皿中，解剖出鼠胚，以Hanks溶液消洗。

　　(2)除掉四肢、大脑及内脏（肝脏）。

　　(3)用无菌Hanks溶液＋PBS漂洗3次。

　　(4)置培养皿中，用手术剪切碎。

　　(5)将剪碎组织移入50ml离心管中，加入约10ml消化液。

　　(6)37°C摇育10min（置水浴或孵育箱中）。

　　(7)吸5ml上清液放入另一50ml离心管中，加等体积含10％新生牛血清的DMEM培养液中和胰蛋白酶。

　　(8)再加入4ml消化液至原离心管（内含组织），颠倒摇动，10min后再吸出5ml上清液到另一离心管中，加入5ml含10%新生牛血清的DMEM培养液。

　　(9)重复上一步骤5次左右，此时离心管中仅剩无法消化的软骨等。

　　(10)离心50ml离心管，加50ml含10％新生牛血清的DMEM培养液。

　　(11)取适量移到培养皿或培养瓶中培养。

　　(12)第二天换液，直到细胞长满（汇合），1:10传代，再生长至合适密度时可进行冻存。

　　(13)根据实验需要复苏细胞，由于MEF细胞传代数有限，实验时应尽可能保留相同代数的细胞进行平行实验。

　　2.处理或γ-射线处理用作饲养层的MEF细胞还须进行处理或干射线处理，步骤如下。

　　（1）处理

　　复苏冻存的MEF细胞(5×104个/cm2，保证用时满满一层，不留空间。

　　汇合状态下的MEF加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml丝裂霉紊的DMEM培养液，37°C、5%CO2培养箱中培养2~3h。

　　以PBS漂洗数次，胰蛋白酶消化，以每分钟1000转的速率离心5min,收集沉淀，用新培养液悬浮，调整浓度为3×105g个/ml。

　　将细胞接种于经明胶预处理的培养皿中。（明胶预处理：0.1％明胶溶液浸泡2h,移走多余的明胶，待自然干燥。）

　　(2)γ-射线处理

　　汇合状态的MEF细胞，以30~100Gy的γ－射线处理。

　　胰蛋白酶消化，收集细胞，离心（每分钟1000转，10min)、计数，接种到明胶预处理的培养皿中。Y-射线处理过的细胞也可以5×106个／ml的浓度冻存起来。复苏后，1支冻存管可接种到4~5块直径6cm的培养皿中。