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小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养要注意的事项

发表时间:2022-10-28  |  点击率:385
     小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为原代培养细胞,其刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富,常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子,另一方面保持干细胞的未分化状态。虽然MEF传代次数有限,但可早期冻存一些,不断复苏,保持长期使用。MEF的缺点是无法耐受G418的筛选。替代方法是从持续表达neo抗性的小鼠品系或转基因品系来分离培养MEF。利用各种转基因鼠培养的MEF细胞还是各种基因功能研究的良好工具。
  (一)材料
  12.5~14.5d的小鼠胚胎(3~6只小鼠/次),培养皿(直径10cm),DMEM+10%新生牛血清,15cm或50cm离心管(圆底),PBS配制的0.05%胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液,手术刀、镊子、剪子等器械。
  (二)操作步骤
  1.一般操作
  (1)在培养皿中,解剖出鼠胚,以Hanks溶液消洗。
  (2)除掉四肢、大脑及内脏(肝脏)。
  (3)用无菌Hanks溶液+PBS漂洗3次。
  (4)置培养皿中,用手术剪切碎。
  (5)将剪碎组织移入50ml离心管中,加入约10ml消化液。
  (6)37°C摇育10min(置水浴或孵育箱中)。
  (7)吸5ml上清液放入另一50ml离心管中,加等体积含10%新生牛血清的DMEM培养液中和胰蛋白酶。
  (8)再加入4ml消化液至原离心管(内含组织),颠倒摇动,10min后再吸出5ml上清液到另一离心管中,加入5ml含10%新生牛血清的DMEM培养液。
  (9)重复上一步骤5次左右,此时离心管中仅剩无法消化的软骨等。
  (10)离心50ml离心管,加50ml含10%新生牛血清的DMEM培养液。
  (11)取适量移到培养皿或培养瓶中培养。
  (12)第二天换液,直到细胞长满(汇合),1:10传代,再生长至合适密度时可进行冻存。
  (13)根据实验需要复苏细胞,由于MEF细胞传代数有限,实验时应尽可能保留相同代数的细胞进行平行实验。
  2.处理或γ-射线处理用作饲养层的MEF细胞还须进行处理或干射线处理,步骤如下。
  (1)处理
  复苏冻存的MEF细胞(5×104个/cm2,保证用时满满一层,不留空间。
  汇合状态下的MEF加入新配制的含10%新生牛血清、10μg/ml丝裂霉紊的DMEM培养液,37°C、5%CO2培养箱中培养2~3h。
  以PBS漂洗数次,胰蛋白酶消化,以每分钟1000转的速率离心5min,收集沉淀,用新培养液悬浮,调整浓度为3×105g个/ml。
  将细胞接种于经明胶预处理的培养皿中。(明胶预处理:0.1%明胶溶液浸泡2h,移走多余的明胶,待自然干燥。)
  (2)γ-射线处理
  汇合状态的MEF细胞,以30~100Gy的γ-射线处理。
  胰蛋白酶消化,收集细胞,离心(每分钟1000转,10min)、计数,接种到明胶预处理的培养皿中。Y-射线处理过的细胞也可以5×106个/ml的浓度冻存起来。复苏后,1支冻存管可接种到4~5块直径6cm的培养皿中。
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