大鼠肺动脉平滑肌细胞的分离和培养要点

 

一、实验前准备选用 6–8 周龄 SPF 级 SD 大鼠，术前 75% 乙醇消毒。器械高温高压灭菌，配制含双抗的 D-Hank’s 液、胶原酶 Ⅱ 与弹性蛋白酶混合消化液，培养基采用 DMEM/F12 添加 15% 胎牛血清、双抗及平滑肌细胞生长添加剂，全程在超净台内操作。

 

二、组织分离与预处理麻醉大鼠后开胸取心肺组织，置于预冷 D-Hank’s 液中，在体视显微镜下剥离肺动脉主干及分支，仔细剔除外膜脂肪与结缔组织，轻柔刮除内膜内皮细胞，仅保留中膜层，避免杂细胞污染。将纯化血管剪为 1mm³ 小块，用 D-Hank’s 液漂洗 2–3 次，去除血液与组织碎屑。

 

三、酶消化与细胞获取将组织块转入混合消化液，37℃恒温消化 60–90 分钟，期间每 15 分钟轻柔吹打一次。消化结束后加入含血清培养基终止反应，通过 70μm 细胞筛过滤去除未消化组织，滤液离心弃上清，用完全培养基重悬沉淀，获得原代细胞悬液。

 

四、接种与差速贴壁纯化细胞悬液接种于培养瓶，37℃、5% CO₂培养箱静置。利用平滑肌细胞与成纤维细胞贴壁速度差异，采用差速贴壁法纯化：接种后 90 分钟轻轻吸出未贴壁细胞，更换新鲜培养基，去除快速贴壁的成纤维细胞，提高 RPASMCs 纯度。

 

五、培养与传代质控细胞贴壁伸展后呈梭形，汇合时形成典型峰谷排列。待融合达 80%–90% 时传代，用 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化，传代比例 1:2，建议使用 P3–P6 代细胞用于实验，避免老化表型改变。每日观察形态，定期用 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光鉴定，阳性率需＞90%。

 

六、关键注意事项全程严控无菌，防止真菌与细菌污染；消化时间需精准把控，避免过度消化损伤细胞；培养基 2–3 天更换一次，维持营养与 pH 稳定。规范操作可获得高活性、高纯度 RPASMCs，为肺血管重构与药物筛选研究提供可靠模型。