本操作以乳鼠（1~3 日龄）关节软骨为材料，采用酶消化法分离原代软骨细胞，全程遵循无菌操作原则，操作时长约 3~4h，细胞得率和活性均较优，步骤如下：
- 实验前准备：超净工作台紫外灭菌 30min，将 0.25% 胰蛋白酶、0.1%Ⅱ 型胶原酶置于 37℃水浴预热；乳鼠经 75% 乙醇全身浸泡消毒 5min，无菌条件下断头处死后，迅速取四肢关节（膝关节、髋关节为主），放入预冷的 PBS 缓冲液（含双抗）中漂洗，去除皮毛、肌肉、韧带等结缔组织，仅保留乳白色透明软骨组织。
- 软骨组织剪碎：将纯化后的软骨组织转移至无菌培养皿，用无菌眼科剪反复剪碎至 1mm³ 左右的匀浆状，期间用 PBS 漂洗 2~3 次，弃去上清，去除残留血细胞和组织碎屑。
- 分步酶解消化：向剪碎的软骨组织中加入适量预热的 0.25% 胰蛋白酶，37℃恒温摇床（100r/min）消化 30min，弃去胰酶（去除杂细胞）；加入 0.1%Ⅱ 型胶原酶，液面没过组织即可，继续 37℃恒温摇床（80~100r/min）消化 2~3h，期间轻摇培养瓶 2~3 次，至软骨组织完全消散，形成浑浊的细胞悬液。
- 细胞过滤与离心：将消化后的细胞悬液通过 200 目无菌尼龙滤网过滤，去除未消化的组织残渣；滤液移入无菌离心管，1000r/min 室温离心 5min，弃去上清酶液，用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基重悬细胞沉淀，再次 1000r/min 离心 5min，洗涤 2 次。
- 细胞计数与接种：用适量完全培养基重悬最终细胞沉淀，取少量细胞悬液与台盼蓝染液 1:1 混合，显微镜下计数，调整细胞浓度至 1×10⁶~2×10⁶个 /mL；将细胞悬液接种至培养瓶 / 皿，置于 37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养。
- 后续初培养处理：接种后 24h 内不换液，让细胞充分贴壁；24h 后首次换液，弃去未贴壁的死细胞和残留杂质，后续每 2~3 天换液一次，待细胞融合至 80%~90% 时，即可进行传代培养。
关键注意事项：酶解时间需严格把控，胶原酶消化过久会损伤细胞活性；全程操作轻柔，避免机械力破坏软骨细胞；所有耗材均需无菌处理，PBS 和培养基全程预冷，减少细胞应激。
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更新时间：2026-01-30
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