小鼠原代主动脉内皮细胞怎么获得

　　小鼠原代主动脉内皮细胞的获取可通过以下步骤实现，结合酶消化法与差速贴壁技术，可获得高纯度细胞：
 

　　一、实验准备
 

　　实验材料
 

　　试剂：磷酸盐缓冲液(PBS，无钙镁)、胶原酶(Type II，0.1%-0.2%)、内皮细胞培养基(如DMEM/F12+20%FBS+1%ECGS+1%青霉素/链霉素)、70%乙醇(消毒用)、红细胞裂解液(可选)。
 

　　仪器：超净工作台、CO₂培养箱(37℃，5%CO₂)、手术器械(眼科剪、镊子、显微镊)、细胞筛(100μm和40μm)、离心机、0.1%明胶包被的培养皿。
 

　　实验动物
 

　　选用健康成年小鼠(如C57BL/6品系)，通过CO₂窒息或颈椎脱臼法处死，并用70%乙醇消毒体表。
 

　　二、主动脉分离与清洗
 

　　暴露主动脉
 

　　沿腹中线剪开胸腔和腹腔，暴露心脏和主动脉。
 

　　用镊子提起心脏，剪断主动脉弓，沿胸主动脉向下分离至髂动脉分叉处，完整取出主动脉。
 

　　去除杂质
 

　　将主动脉置于预冷的PBS中，去除周围脂肪和结缔组织。
 

　　纵向剪开主动脉，用PBS冲洗3次以清除血液和细胞碎片。
 

　　三、酶消化与细胞释放
 

　　胶原酶消化
 

　　将主动脉浸泡于0.1%-0.2%胶原酶溶液中，37℃孵育15-30分钟，期间轻柔振荡促进消化。
 

　　消化完成后，加入含血清的培养基终止反应。
 

　　细胞收集
 

　　用移液枪反复吹打主动脉碎片，释放内皮细胞。
 

　　过100μm和40μm细胞筛去除未消化组织，收集细胞悬液。
 

　　离心(1000rpm，5分钟)后弃上清，用内皮细胞培养基重悬细胞。
 

　　四、细胞纯化与培养
 

　　差速贴壁法
 

　　将细胞悬液接种于未包被的培养皿中，37℃静置1小时，使成纤维细胞优先贴壁。
 

　　收集未贴壁的内皮细胞，转移至0.1%明胶包被的培养皿中，提高贴壁率。
 

　　磁珠分选(可选)
 

　　使用CD31或CD144抗体标记内皮细胞，通过磁珠分选进一步提高纯度。
 

　　细胞培养
 

　　将纯化后的细胞接种于包被的培养皿中，加入内皮细胞培养基。
 

　　置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，每2-3天换液一次。
 

　　观察细胞形态，呈“鹅卵石样”铺路石状时表明细胞状态良好。
 

　　细胞传代
 

　　当细胞融合度达80%-90%时，用0.25%胰酶消化传代，按1:2或1:3比例接种。
 

　　原代内皮细胞传代次数建议不超过5代，以防表型丢失。
 

　　五、关键注意事项
 

　　无菌操作：所有步骤需在超净工作台内进行，避免污染。
 

　　消化时间控制：胶原酶消化时间过长可能导致细胞损伤，需优化实验条件。
 

　　细胞鉴定：通过免疫荧光检测CD31、vWF或eNOS等内皮标志物确认细胞纯度(纯度应高于90%)。
 

　　避免过度传代：原代内皮细胞传代次数有限，过度传代可能导致功能丧失。