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大鼠软骨细胞的制备要注意的事项

发表时间:2022-08-27  |  点击率:624
  软骨细胞是软骨组织中的主要细胞成分。位于软骨陷窝中。软骨细胞的核小,呈圆形或椭圆形,有1至数个核仁,胞质略嗜碱性。细胞形状依软骨组织而异:在透明软骨,靠近软骨膜的细胞呈椭圆形,其长轴与软骨表面平行,深部的细胞逐渐变为圆形或卵圆形,常常两个或多个聚集成群,称为同源细胞群;在弹性软骨,细胞的形态基本上与透明软骨的相似;在纤维软骨,细胞略呈卵圆形,夹在胶原纤维束之间,单个存在、成对存在或排列成单行。大鼠软骨细胞分离自卵巢组织;卵巢是雌性动物的生殖器官,卵巢的功能是产生卵以及类固醇激素。卵巢的位置与睾丸相同,仅左侧发育(右侧已退化),呈葡萄状,均为处于不同发育时期的卵泡,卵泡呈黄色,卵巢表面密布血管。卵巢的大小与年龄和产卵期有关。
  1)大鼠关节软骨细胞的取材、培养及细胞一般生物活性测定
  取4~5周龄,体重185~200g的SD大鼠,断颈处死,置于5%CO2混和气体环境中,37℃恒温箱内单层培养,隔3d初次换液,8~10d达85%融合后进行传代。以台盼蓝染色法计算细胞活性。活性细胞获得率(个/g)=细胞总数/软骨消化量。细胞存活率(%)=活性细胞总数/(活性细胞总数+死细胞总数)×100%。细胞贴壁率(%)=(接种细胞总数-漂浮细胞数)×100%。软骨细胞群体倍增时间(doubblingtimeDT)的测定:DT=(t-t0)log2/(logn-logn0)。接种时培养时间t0,细胞计数为n0;收集时培养时间为t,细胞计数为n。
  2)倒置相差显微镜下形态学观察
  取每代贴壁软骨细胞于倒置相差显微镜观察细胞生长情况。倒置相差显微镜观察:原代软骨细胞9~12h部分贴壁,大部分在24h时完成贴壁,部分细胞开始伸展,细胞体积较小,呈多角形,均匀散在生长,48h内基本上铺展成三角或多角形;7~10d达到90%融合形成单层细胞,细胞仍呈多角形或短梭形,细胞排列紧密,折光性强。传代细胞贴壁时间为2~4h,第1~2代细胞生长旺盛,3~4d细胞即可融合,细胞呈多角形小部分细胞形态狭长。第3代细胞形态逐渐变狭长,折光性减弱。第5代以后,均呈长梭型老化。8、9代后细胞梭状铺平,镜下长而大,折光差,部分细胞脱落,形态不规则。
  3)软骨细胞透射电镜观察胰酶消化各代次软骨细胞,离心后先于离心管培养3d,送福建医大电镜室制片观察。经离心管培养3d后,固定标本进行电镜技术观察,原代P0培养软骨细胞为卵圆形或圆形,细胞核清晰,较多异染色质分布于核膜边缘和核内。胞浆内有较多糖原颗粒和分泌囊泡,胞浆内含有丰富的内质网和高尔基体。细胞周围和细胞间可见网络样结构及少量胶原纤维和蛋白聚糖,但是结构较稀疏,排列较乱,缺乏紧密的胶原网络结构。传代后P1软骨细胞体积逐渐增大,胞浆内细胞器减少。细胞外胶原纤维增粗,量变少,蛋白聚糖进一步减少,末发现凋亡软骨细胞。P2代软骨细胞为三角形或卵圆形,细胞核及核仁清晰,少许异染色质沿核膜均匀分布,核内以常染色质为主。胞浆内有较多糖原颗粒和分泌囊泡,内质网和线粒体较丰富。
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